上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4489	规格：100T/96S	微量法
货号：UPLC-MS-4488	规格：50T/48S	可见分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：有毒易挥发试剂，涉及该试剂的步骤建议在通风橱内操作。

2、 试剂五：临用前加入 2.5 mL 蒸馏水，溶解后-20℃分装保存；

3、 试剂六：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂六、蒸馏水按 1:20（V:V）的比例配制备用， 现用现配；

4、 标准品：用 1 mL 蒸馏水溶解，浓度为 10 mg/mL，4℃保存。

产品说明：

氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG 会被谷胱甘肽还原酶还原成 GSH，因此机体中大多数是以还原型形式存在。测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。本试剂盒利用谷胱甘肽能和 5,5’- 二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸，2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长 412nm 处具有*大光吸收的特点，通过 2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将 GSSG 还原为 GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。

技术指标：

*低检出限：3.211 μg/mL

线性范围：3.9-125 μg/mL

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

分析天平、匀浆器/研钵、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

（1） 组织处理

新鲜组织首先用 PBS 冲洗 2 次，然后称取动物组织或者植物组织 0.1g。加入用试剂一润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入 1mL 试剂一（组织/试剂一比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000g，4℃离心 10min；取上清液放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

 （2） 血液处理

血浆：将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的试剂一，4℃，8000g 离心 10 分钟，将上清移入新的试管中放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。血细胞：将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，弃去上层血浆用 3 倍体积的 PBS 清洗 3 次（用 PBS 重悬血细胞，600g 离心 10 分钟），加入等体积试剂一，混匀后 4℃放置 10 分钟，8000g 离心 10 分钟，吸取上清放于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

 （3） 细胞处理

收集不少于 500 万个细胞，首先用 PBS 清洗细胞 2 次（PBS 重悬细胞，600g 离心 10 分钟），加入 1mL 试剂一重悬细胞，反复冻融 2-3 次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解）或者进行超声（200W，超 3s，停 10s，重复 30 次），8000g 离心 10 分钟，收集上清于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

二、测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、试剂二放置 37℃（哺乳动物）或 25℃（一般物种）水浴中保温 30min。

3、标准品的稀释：取适当溶液配制浓度为 125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、7.8125μg/mL、

3.90625μg/mL、0μg/mL 的标准品（试剂一十倍稀释后进行稀释）。

4、取 0.5mL 离心管，加入 20μL 稀释好的标准品或样本，加入 1μL 试剂二，混匀后 37℃孵育 30 分钟。

5、制作标准曲线

孵育完成后标准管（0μg/mL 为空白管）依次加入 140μL 试剂三，20μL 试剂四，20μL 试剂五，2μL 试剂六（加入试剂六即开始计时），迅速混匀后，测定 412nm 处 30s 和 150s 光吸收 A1 和 A2，计算 ΔA 标准=A2-A1。以吸光度（ΔA 标准-ΔA 空白）为横坐标（x），浓度为纵坐标（y）做标准曲线。

6、样本管依次加入 140μL 试剂三，20μL 试剂四，20μL 试剂五，2μL 试剂六（加入试剂六即开始计时），迅速混匀后，测定 412nm 处 30s 和 150s 光吸收 A1 和 A2，ΔA 测定= A2-A1。

三、GSSG含量计算

根据标准曲线，将样本（ΔA 测定-ΔA 空白）带入公式中（x），计算出样本浓度 y（μg/mL）。

（1） 按蛋白浓度计算

GSSG（μg/mg prot）=y×V 样÷(V 样×Cpr )=y÷Cpr

（2） 按样本质量计算

GSSG（μg/g 质量）=y×V 样÷(V 样÷V  样总×W)=y÷W

（3） 按细胞数量计算