乙酰胆碱酯酶( AchE) 活性检测试剂盒-乙酰胆碱酯酶( AchE) 试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4403 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-4402 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 70 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 30 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

4℃保存

试剂三

粉剂×1

4℃保存

试剂四

粉剂×1

4℃保存

溶液的配制:

1. 试剂二:临用前加入 5.2 mL 试剂一充分震荡溶解;

2. 试剂三:临用前加入 2.6 mL 试剂一充分震荡溶解;

3. 试剂四:临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解,备用。

产品说明:

AchE 属于丝氨酸水解酶,广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE 催化乙酰胆碱(Ach)水解,在神经传导调节中起重要作用。

AchE 催化 Ach 水解生成胆碱,胆碱与二硫对硝基苯甲酸(DTNB)作用生成 5-巯基-硝基苯甲酸(TNB);TNB 412nm 处有吸收峰,通过测定 412nm 吸光度增加速率,计算 AchE 活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液 进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心 10min,取上清液待测。

2. 细菌、细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

二、测定步骤:

1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。

2. 样本测定:

试剂名称(μL)

测定管

对照管

样本

15

15

试剂二

50

-

37℃  水浴准确反应5min

试剂四

50

50

试剂二

-

50

混匀后12000rpm常温离心5min。分别吸取10μL上清液于新的EP管或96孔板中,之后分别加入。

试剂一

170

170

试剂三

20

20

混匀,放置2min后于微量玻璃比色皿中或96孔板中测定412nm处的吸光度,记为A测定管,A对照管,计算ΔA=A测定管-A对照管。

三、AchE 酶活计算公式

A、用微量玻璃比色皿测定计算公式:

1. 组织 AchE 活性

(1) 按照蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 1 个酶活单位。

AchE 酶活(U/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V 显色×109] ÷(Cpr ×V 样×V 上清÷V 酶促)÷T=2255×ΔA ÷Cpr。

(2) 按照样本质量计算

活性单位定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 1 个酶活单位。

AchE 酶活(U/g  质量)=[ΔA÷(ε×d)×V 显色×109]÷(W ×V 样÷V 样总×V 上清÷V 酶促)÷T =2255×ΔA÷W。

2. 细菌、细胞 AchE 活性

活性单位定义:每 104 个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 1 个酶活单位。

AchE 酶活(U/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V 显色×109]÷(细胞数量×V 样÷V 样总×V 上清÷V 酶促)÷T=2255×ΔA÷细胞数量

3. 血清 AchE 活性

活性单位定义:每毫升血清每分钟催化产生 1nmol TNB 1 个酶活单位。

AchE 酶活(U/mL)= [ΔA÷(ε×d)×V 显色×109]÷(V 样×V 上清÷V 酶促)÷T =2255×ΔA

ε:TNB 摩尔消光系数,13.6×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 显色:显色反应体系总体积(L) 0.2mL=2×10-4L;109:单位换算系数,1mol=1×109nmol;V 酶促:酶促反应总体积,0.115mL;V 上清:吸取上清液体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V 样:加入样本体积(mL),0.015mL;T:反应时间(min),5min;细胞数量:提取时的细胞数量,万个。

B、用 96 孔板测定的计算公式:

将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm 进行计算即可。

注意事项:

1. 测定过程中样本和工作液在冰上放置,以免变性和失活。

2. 当吸光值大于 1 时,建议将样本稀释后测定。


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