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试剂名称
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规格
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保存条件
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提取液
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液体 110 mL×1 瓶
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4℃保存
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试剂一
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液体 5 mL×1 瓶
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4℃保存
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试剂二
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液体 4 mL×1 瓶
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4℃保存
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试剂三
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粉剂×2 瓶
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-20℃保存
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试剂四
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粉剂×2 瓶
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-20℃保存
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试剂五
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液体 40μL×1 支
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4℃保存
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试剂六
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液体 5mL×1 瓶
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4℃保存
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试剂七
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粉剂×1 支
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4℃保存
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溶液的配制：
1、 提取液：临用前将试剂七加入到提取液中，勿放于-20℃；
2、 试剂三：临用前每瓶加入 2.5mL 蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；
3、 试剂四：临用前每瓶加入 5mL 蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；
4、 试剂五：使用前需先离心。根据用量按照试剂五:蒸馏水为 1:8 的体积比例充分混匀，现用现配；
5、 工作液配制：按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=29:35:42:42:3的比例将各试剂混合后备用（共151μL，1T的量），根据样本数量现用现配。
产品说明：
ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。
2、组织处理：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定：将试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔 UV 板中，加试剂六的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 10 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟（如果酶标仪有控温功能可以将温度设置为 37℃或 25℃）；迅速取出比色皿并擦干，340nm 下比色，记录 2 分 10 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。
三、ICL 活性计算
A. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、组织中ICL活力的计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/mg prot）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=2297×ΔA÷Cpr
（2） 按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/g 质量）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(W÷V提取×V样本) ÷T=2297×ΔA÷W
V反总：反应总体积，0.2×10-3L；V样本：加入样本体积，0.007mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：微量石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；T： 反应时间，2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
2、细菌或培养细胞中ICL活力的计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/mg prot）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=2297×ΔA÷Cpr
（2） 按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/104 cell）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(500÷V提取×V样本) ÷T=4.59×ΔA
V反总：反应总体积，0.2×10-3L；V样本：加入样本体积，0.007mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：微量石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；500：细菌或细胞数量，500万；T：反应时间，2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
B. 用96孔板测定的计算公式如下
1、组织中ICL活力的计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/mg prot）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=3828×ΔA÷Cpr
（2） 按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/g 质量）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(W÷V提取×V样本) ÷T=3828×ΔA÷W
V反总：反应总体积，0.2×10-3L；V样本：加入样本体积，0.007mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：96孔UV板光径，0.6cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；T： 反应时间，2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
2、细菌或培养细胞中ICL活力的计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/mg prot）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=3828×ΔA÷Cpr
（2） 按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/104 cell）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(500÷V提取×V样本) ÷T=7.65×ΔA
V反总：反应总体积，0.2×10-3L；V样本：加入样本体积，0.007mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：96孔UV板光径，0.6cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；500：细菌或细胞数量，500 万 ；T：反应时间，2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。96 孔 UV 板测定时，不推荐同时测多个样本。
生化检测
液相（HPLC）检测
